АКТУАЛЬНІ МІКРОБІОЛОГІЧНІ ТА БІОХІМІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ

Іваненко Н.О.

асистент кафедри медичної біології, мікробіології, вірусології та

імунології Донецького національного медичного університету

м. Кропивницький, Україна

Біохімія мікроорганізмів включає вивчення росту, структури, метаболізму мікроорганізмів, первинних та поглиблених функцій та взаємодії біологічних макромолекул, таких як вуглеводи, білки, жирні кислоти, ліпіди та нуклеїнові кислоти, які створюють основу існування. Приховані геномні ознаки у пост-геномну еру, механізми реплікації, інтеграція плазмідних функцій, кон'югація та регуляторна взаємодія є ключовими факторами, які відіграють важливу роль у метаболізмі мікроорганізмів.

Молекулярні методи все частіше використовуються в лабораторії, зокрема, для виявлення та характеристики ізолятів, а також для діагностики захворювань, зумовлених гострими, повільно зростаючими, нежиттєздатними або організмами, які складно культивувати та виявити традиційними методами виділення культури.

Молекулярні методи широко класифікують як:

Методи гібридизації - краще для ідентифікації, а не такі чутливі, як методи підсилення

Методи ампліфікації - поліпшення чутливості внаслідок кроку посилення.

Секвенування та ферментативне перетравлення нуклеїнових кислот.

Методи гібридизації базуються на здатності двох ниток нуклеїнових кислот, які мають комплементарну послідовність основи (тобто є гомологічною), зв'язуватися один з одним і утворювати дволанцюгову молекулу (гібрид). Оскільки гібридизація вимагає гомології послідовності, позитивна реакція гібридизації між двома нитками нуклеїнових кислот, кожен з яких походить з різних джерел, свідчить про генетичний зв'язок між цими двома організмами. Аналізи гібридизації вимагають, щоб одна нитка нуклеїнових кислот була відомим організмом, а інша похідна від організму, щоб бути ідентифікована або виявлена. Клінічні застосування методів гібридизації для  виявлення збудників, наприклад, фарингітів (gp-A стрептококи), інфекції статевих шляхів (N.gonorrhoeae, C.trachomatis), мікобактерій.

Метод ампліфікації почався використовуватися наприкінці 80-х років з розробкою ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція -PCR). Методи ампліфікації поліпшують чутливість за рахунок посилення. Всі етапи ПЛР виконуються на реакційній суміші, що складається з цільової ДНК, пар праймерів, термостабільної ДНК-полімерази, деоксинуклеотидів (dATP, dTTP, dGTP та dCTP), буферу та Mg-солі у тій же пробірці. Після певної кількості циклів  ПЛР досягає фази плато. Плато-фаза ПЛР показує, що майже одна і та ж кількість ампліфікованих продуктів, незалежно від початкової кількості шаблонів, буде отримано достатніми циклами ПЛР. Звичайні проблеми в ПЛР – помилки  внаслідок наявності інгібіторів ПЛР, поганої ізоляції нуклеїнових кислот та поганої ефективності ампліфікації та помилкових спрацьовувань внаслідок забруднень. Існують різні методи перевірки ПЛР генерованих ампліконів, які  придатні для диференціювання цілей ампліфікації від неспецифічної ампліфікації. Клінічне застосування цього методу важливе для визначення, наприклад, ВІЛ, вірусу гепатиту В, вірус гепатиту С, моніторинг ВІЛ-хворих на ламівудин, диференціювання ентеровірусів від інших вірусів.

Секвенування ДНК означає визначення порядку нуклеотидів в молекулі ДНК, для якої проводиться екстракція плазмід або хромосомної ДНК. Цей метод може бути використаний для вивчення структури гена, виявлення мутацій та порівняння генетичної залежності та розробки олігонуклеотидних праймерів. Поліморфізм (або мінливість) у нуклеотидній послідовності присутній у всьому організмі, включаючи мікроби. Метод RFLP (Restriction fragment length polymorphism - поліморфізм довжини обмеження фрагмента)

 спирається на зміни бази пар в рестрикційних сайтах, які виникають внаслідок мутацій. Обмежувальні ферменти (RE) розрізають ДНК на спеціальні ділянки з впізнаваними 4-6 bp  фрагментами, розділеними відповідно до розміру молекули за допомогою гель-електрофорезу. Відмінності, що виникають в результаті базових заміщень, доповнень, делецій або перестановок послідовностей у послідовності розпізнавання РЕ, можуть бути виявлені за допомогою цієї методики, наприклад для визначення зміни штаму у М. tuberculosis.

Різні комерційні випробування, засновані на нуклеїнових кислотах, були розроблені та впроваджені в стандартну практику різних лабораторій по всьому світу. У багатьох лабораторіях також розроблені "внутрішні" тести. Внутрішні розроблені випробування мають потенційні переваги зниження вартості та можуть дозволити тестування мікроорганізмів, які не мають комерційно доступних варіантів. Однак ступінь стандартизації та цінності буде залежатиме від центру.

Список використаних джерел:

1. Kevin B. Laupland, Louis Valiquette.  The changing culture of the microbiology laboratory. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2013; 24(3): 125–128.
2. P. Dandekar and A. M. Rishi. The Dynamic Roles Played by a Biochemist. Indian J Clin Biochem. 2014; 29(4): 395–397.
3. Alex van Belkum, Ph.D., 1 Géraldine Durand, M.D.,1 Michel Peyret, Ph.D.,1 Sonia Chatellier, Ph.D.,1 Gilles Zambardi, Ph.D.,1 Jacques Schrenzel, M.D.,2 Dee Shortridge, Ph.D.,3 Anette Engelhardt, Ph.D.,3 andWilliam Michael Dunne, Jr, Ph.D. Rapid Clinical Bacteriology and Its Future Impact Ann Lab Med. 2013; 33(1): 14–27.
4. Khardori N. Future of diagnostic microbiology. Indian J Med Microbiol. 2014;32(4):371-7.
5. Malhotra S, Sharma S, Bhatia NJK, Kumar P, Hans C (2014) Molecular Methods in Microbiology and their Clinical Application. J Mol Genet Med. 2014; 8:142.
6. Lecuit M, Eloit M. The diagnosis of infectious diseases by whole genome next generation sequencing: a new era is opening. Front Cell Infect Microbiol. 2014; 6;4-25.